牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)熒光PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：

通用名稱：牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)熒光PCR試劑盒

Name：Bovine Viral Diarrhea Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method) 50T/盒

包裝規(guī)格：50T/盒

預期用途：

本試劑盒適用于檢測的牛的腸粘膜、腸系膜淋巴結(jié)組織、排泄物等標本中牛病毒性腹瀉病毒核酸，適用于牛病毒性腹瀉病毒感染的輔助診斷。

檢驗原理：

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設計一對牛病毒性腹瀉病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對牛病毒性腹瀉病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

試劑組成：

說明： 不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

保存條件及有效期：

-20℃±5℃ ，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

適用儀器：

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

標本采集：

病死或撲殺牛，取腸粘膜、腸系膜淋巴結(jié)組織； 待檢活牛，取排泄物，放入 1mL50%甘油生理鹽水中。

保存和運輸：

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。

使用方法：

1.樣本處理（樣本處理區(qū)）

樣本前處理

A組織樣品： 每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)/剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液 100μL于 1.5mL 滅菌離心管中； 咽拭/子樣品直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

B核酸提取

推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取/或純化試劑（磁珠法或離心柱法） 進行核酸提取，請按照試劑說明書進行操

作。

2.試劑配置（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照； 樣品每滿

10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，

短暫離心。

4.PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為  25μL；

熒光通道選擇：   檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5.1結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~ 15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性： 檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑： 檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38 ，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性： 樣本檢測結(jié)果Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品： Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品： 擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.  陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

注意事項：

1. 所有操作嚴格按照說明書進行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；

3. 反應液應避光保存；

4. 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》 進行處理。